Pyrosequencing

(จาก www.pyrosequencing.com)

1. ในปฏิกิริยา sequencing ที่มี primer, DNA template, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase และ apyrase และ substrate APS (adenosine 5’ phosphosulfate และ luciferin
2. เติม dNTP ทีละ 1 ตัว ถ้าdNTP นั้นสามารถจับคู่กับ DNA template ได้ DNA polymerase จะนำเอา dNTP นั้นๆ เข้าต่อกับสายดีเอ็นเอ และปลดปล่อย pyrophosphate (PPi) ในปริมาณที่เท่ากับจำนวน nucleotide ที่ต่อเข้าไป

3. เอนไซม์ ATP sulfurylase จะเปลี่ยน PPi เป็น ATP โดยจะรวมเข้ากับ APS ซึ่ง ATP ก็จะไปช่วย luciferase ในการ เปลี่ยน luciferin เป็น oxyluciferin และปล่อยแสงออกมาในปริมาณที่เป็นสัดส่วนกับ ปริมาณ ของ ATP สามารถตรวจจับแสงที่ปลดปล่อยออกมาโดยใช้กล้อง CCD โดยแสดงออกมาเป็น peak (Pyrogram) ความสูงของ peak ก็เป็นสัดส่วนกับจำนวน nucleotide ที่ DNA polymerase ต่อสายดีเอ็นเอ

4. เอนไซม์ apyrase จะย่อย ATP และ nucleotide ที่ไม่ถูกนำไปต่อสาย ทำให้หยุดปฏิกิริยาปลดปล่อยแสง จากนั้นก็จะเริ่มการเติม dNTP ชุดถัดไป

5. การเติม dNTPs จะเติมทีละ 1 ตัว และในระหว่างที่ปฏิกิริยาดำเนินต่อเนื่อง ก็จะมีการสร้างดีเอ็นเอสายคู่สม (complementary strand) พร้อมกับการอ่านลำดับเบสจาก Pyrogram