การทำสไลด์ถาวรของหนอนตัวกลมขนาดเล็ก (Nematode)

การทำให้หนอนตัวกลมสลบหรือชา (anesthetics)

1. ไดคลอโรเอทิล อีเทอร์ (dichloroethyl ether) ใช้สารเคมีชนิดนี้ 2 หยด ผสมกับน้ำ 50 มล. จะทำให้หนอนตัวกลมสลบ หรือเคลื่อนไหวไม่ได้ (Goodey, 1963) และใช้ครอบคลุมถึงการที่จะเปลี่ยนหนอนตัวกลม มาสู่น้ำใหม่

2. ใช้ 3-ฟีนอกซีโพรพานอล หรือโพรพิลีน ฟีนอกซิทอล (3-phenoxypropanol or propylene phenoxetol) ใช้ได้ดีกับหนอนตัวกลมที่อยู่อย่างอิสระ (free living) และที่เป็นปาราสิตใน 3. ก๊าซต่างๆ มีหลายชนิด (Maggenti and Viglierchio, 1965) พบว่า

- ก๊าซฟรีออน-12 และฟรีออน-22 ทำให้หนอนตัวกลมไม่เคลื่อนไหวในเวลา 4 ชม.

- ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ (CO2) pH 4.5 ทำให้หนอนตัวกลมไม่เคลื่อนไหวในเวลา 2 ชม.

- ก๊าซคาร์บอนไดออกไซด์ และฟรีออน 22 ที่ปรับปรุงแล้วจะช่วยให้เห็นลักษณะต่างๆ ของหนอนตัวกลมได้ชัดเจนยิ่งขึ้น ซึ่งก๊าซนี้จะทำให้มีการเปลี่ยนแปลงสรีรวิทยาภายในของหนอนตัวกลม แต่ก็สามารถเปลี่ยนกลับคืนเหมือนเดิมได้

การฆ่า และการดอง หนอนตัวกลม (kill and fixing nematodi)

1. ฆ่าด้วยความร้อน

1.1 ตัวอย่างที่มีจำนวนน้อยๆ สามารถฆ่าได้โดยย้ายไปอยู่ในหยดน้ำบนกลาสสไลด์ (glass slide) แล้วให้ความร้อนโดยตะเกียงแอลกอฮอล์ นาน 2-3 วินาที จนกระทั่งหนอนตัวกลมเหยียดตัวตรง (Goodey, 1963) หรือทำบน hot plate ที่ควบคุมอุณหภูมิระหว่าง 65-70 ° C ซึ่งจะช่วยป้องกันไม่ให้ตัวอย่างได้รับความร้อนมากเกินไป จากนั้นตัวอย่างจะถูกย้ายไปสู่ฟิกเซทีฟ หรือจะ fix บนสไลด์โดยเติมฟิกเซทีฟ ให้มีขนาดของหยดเท่ากับน้ำบนสไลด์

1.2 ตัวอย่างที่มีหนอนตัวกลมหนาแน่นในน้ำที่อยู่ในหลอดแก้ว ปริมาตรประมาณ 3 มล. หรือจากการปั่น (centrifuge) โดยมันจะเกาะ หรือเคลื่อนไหวในน้ำที่อยู่ผิวบน (supernatant) เขย่าหลอดเพื่อให้หนอนตัวกลมกระจายทั่วๆ แล้วนำหลอดไปตั้งในบีกเกอร์ที่มีน้ำอุณหภูมิ 65 ° C นาน 2-3 นาที จากนั้นเติมฟิกเซทีฟ ในปริมาตรที่เท่ากับ supermnatant (Hopper and Evans,)

2. ฆ่าโดยใช้สารเคมีที่ร้อน โดยการเทสารละลาย 0.5% กรดอะซิติก ที่ร้อนเกือบ 100 ° C ลงบนตัวหนอนตัวกลมที่อยู่ในหยดน้ำเล็ก (Seinhorst, 1962)

3. ฆ่าโดยใช้ความเย็นก่อนที่จะ fix คือการแช่แข็งอย่างรวดเร็ว (Hoff and Mai, 1964) โดยการรีบแช่สารแขวนลอย (suspension) ที่มีหนอนตัวกลมอยู่นั้น ในไนโตรเจนเหลวที่มีปริมาตรมากกว่าสารแขวนลอย 4 เท่า แล้วเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิ-35 ° C

    1. มีการฆ่าและ fix ที่รวมอยู่ในขั้นตอนเดียวกันคือใช้ฟอร์มิก อะซีติก (หรือโพรพิโอนิค)

ฟิกเซทีฟ (Formic acetic or Formic propiomic fixative) ซึ่งรู้จักในชื่อทั่วไปว่า FA 4:1 หรือ FP 4:1 (ควรเติม 2% กลีเซอรอลด้วย) ให้ความร้อนประมาณ 99 ° C แล้วรีบใส่ไปในหยดน้ำที่มีหนอนตัวกลมอยู่ให้ปริมาตรของ FA 4:1 มากกว่าน้ำนั้น 3-4 มล. (Seinhorst, 1966)

ฟิกเซทีฟ (Fixative)

ฟิกเซทีฟที่ใช้ fix หนอนตัวกลม มีหลายสูตรให้เลือกใช้ตามความเหมาะสม

    1. ใช้ 5-10% ฟอร์มาลิน แล้วเติมด้วย 2% กลีเซอรอล

2. ฟอร์มอล อะซิติก (FA) หรือฟอร์มอล โพรพิโอนิค (FP) 4:1 มีสูตรคือ

- ฟอร์มาลีน (40% ฟอร์มาลดีไฮด์๗ 10 มล.

- กรดอะซิติก (หรือกรดโพรพิโอนิค) 1 มล.

- กลีเซอรอล 2 มล.

- น้ำกลั่น (เติมจนครบ 100 มล.) คือเติมอีก 89 มล.

3. TAF (Courtney et al, 1955)

- ฟอร์มาลีน (40% ฟอร์มาลดีไฮด์) 7 มล.

- ไตรเอทาโนลามีน (triethanolamine) 2 มล.

- น้ำกลั่น 91 มล.

TFC ฟิกเซทีฟ เป็นที่นิยมใช้เพราะได้เปรียบมากกว่าฟอร์มอลอะซิติก FA หรือ FP 4:1 ตรงที่หนอนตัวกลมยังรักษาสภาพเหมือนที่ยังมีชีวิตออยู่ไว้ได้หลายชั่วโมง อย่างไรก็ตาม TAF ไม่เหมาะกับการเก็บรักษาหนอนตัวกลมระยะยาว เพราะจะทำให้คิวเตเคิล (cutacle) ของหนอนตัวกลมเสื่อมสลายลง ดังนั้นควรเปลี่ยนไปสู่ FA หรือจะเติม FA (FP) 4:1 ที่ผสม 2% กลีเซอรอล ให้มากเกินกว่า TAF ก็ได้ (Hooper, 1987)

การย้อมสีและเคลียริ่งในแลคโตฟีนอล หรือแลคโตกลีเซอรอล (lactophenol or lactoglycerol)

แลคโตฟีนอล เป็นทั้งน้ำยาฟิกเซทีฟ และเคลียริ่งในตัวเอง ดังนั้นหนอนตัวกลมใหม่ๆ สามารถใส่ได้โดยตรง ในแลคโตฟีนอลร้อนๆ ได้เลย แต่กลิ่นของฟีนอลจะเป็นอันตรายต่อสุขภาพ ดังนั้นเพื่อหลีกเลี่ยงฟีนอล Bridge, et al, (1982) แนะนำให้ใช้แลคโตกลีเซอรอลสารละลายนี้ได้จากปริมาตรที่เท่ากันของกลีเซอรอล, กรดแลคติค และน้ำกลั่น และสามารถเติมสี 0.5% เอซิดฟุคซิน (acid fuchsin) หรือ 0.05% เมทิลบลู (methyl blue) โดยจะละลายสีในน้ำก่อนที่จะผสมสารเคมีตัวอื่น สีแอซิดฟุคซินเป็นที่นิยมใช้โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับหนอนตัวกลมที่เป็นปาราสิตในพืช Zhooper and Evans,)

วิธีย้อมสี

ใส่แลคโตฟีนอลหรือแลคโตกลีเซอรอลให้เกือบเต็มสไลด์ ถ้าต้องการสีก็เติมสีไปด้วย แล้วนำไปให้ความร้อนบน hot plate ประมาณ 65 ° C เมื่อแลคโตฟีนอลร้อน ก็ใช้เข็มงอๆ คล้องหนอนตัวกลมที่ผ่านการ fix มาแล้วหลายชั่วโมง หรือข้ามคืนมาใส่ในแลคโตฟีนอลที่ร้อนๆ สไลด์ที่ร้อนนี้ต้องส่องดูด้วยกล้องสเตอริโอประมาณ 2-3 นาที หนอนตัวกลมจะใส ถ้าต้องการให้ใสมากขึ้น หรือติดสีมากขึ้นสามารถนำสไลด์กลับไปให้ความร้อนได้อีก สีที่สวยคือลำตัวของหนอนตัวกลม จะติดสีชมพูบานเย็นใสๆ อวัยวะภายในที่หนาแน่นจะติดสีบานเย็นที่เข้มขึ้นกว่าลำตัว ถ้าไม่ใช้ความร้อนช่วย การติดสี และการเคลียริ่งจะเป็นไปได้ยาก เพราะหนอนตัวกลมมีคิวเตเคิล (cutacle) หนา

สูตรของแลคโตฟีนอล (lactophenol) (อาคม,)

- ฟีนอล (phenol) 10 กรัม

- กลีเซอรีน (glycerine) 10.6 มล.

- กรดแลคติก (lactic acid) 8.2 มล.

- น้ำกลั่น 10 มล.

การเมาต์สไลด์ถาวรของหนอนตัวกลม (Permanent mount)

หยดแลคโตฟีนอล หรือกลีเซอรอลที่ไม่มีน้ำปนหยดเล็กๆ ลงบนกลางสไลด์ที่สะอาด ใช้เข็มงอย้ายหนอนตัวกลมมาที่หยดนี้ (ข้อควรระวังคือ หนอนตัวกลมที่ผ่านขบวนการแลคโตฟีนอล หรือแลคโตกลีเซอรอล จะตัวอ่อนนุ่มมาก ดังนั้นควรช้อนมาด้วยความระมัดระวัง โดยใช้ขนตา หรือขนของแปรงที่อ่อนนุ่มในการเกี่ยวช้อน) จัดตำแหน่งให้หนอนอยู่ตรงกลางๆ หนอนจะสัมผัสผิวสไลด์ไม่ลอยอยู่ที่ด้านบนของหยดนี้ ใช้เศษแก้วเล็กๆ 3 ชิ้น ขนาด 1 มม. วางรอบๆ แต่อยู่ภายในขอบของหยดแลคโตฟีนอล หรือกลีเซอรอลเศษแก้วนี้จะมีประโยชน์ช่วยในการค้ำจุนคัพเวอร์กลาส อาจใช้ลวดสแตเลส ขดเป็นวงกลมแทนเศษแก้วก็ได้

ใช้ปากคีบ (forcep) คีบคัพเวอร์กลาสให้ลนไฟพออุ่นๆ แล้ววางบนหยดของแลคโตฟีนอล หรือกลีเซอรอล ขนาดของหยดควรจะพอดีเมื่อปิดคัพเวอร์กลาสแล้ว ถ้ามีส่วนเกินของแลคโตฟี

นอล หรือกลีเซอรอลออกมารอบนอกของขอบคัพเวอร์กลาสจะทำให้การซีล (seal) รอบๆ คัพเวอร์กลาสไม่ดี คัพเวอร์กลาสจะวางบนเศษแก้ว 3 จุดนั้น จากนั้นใช้สารซีลแลนต์ (sealant) เช่น ซุต (zut), กลีซีล (glyceel) หรือเปอร์เมาต์ (pemount) ยาทาเล็บที่ทำให้เล็บขึ้นเงาอ่อนๆ นั้นเหมาะสมที่สุด การซีลอาจใช้เครื่องมือที่เรียกว่า ริง (ringed) โดยใช้ขนแปรงอ่อนๆ แถบของการซีลควรจะหนาสม่ำเสมอ และไม่กว้างมาก จะให้มั่นใจว่าซีลได้เพียงพอ คือสารซีลแลนต์ต้องอยู่บนขอบของคัพเวอร์กลาส พอๆ กับอยู่บนสไลด์ เมื่อซีลครั้งที่ 1 แห้งแล้ว ให้ทำซ้ำอีกครั้งเพื่อให้การซีลนี้ดี แปรงที่ใช้ทาจะเก็บไว้ในซีแลนต์หรือในหลอดที่มีสารละลาย n-butyl acetate สไลด์ที่ซีลเรียบร้อยแล้วจะเก็บไว้ได้นานหลายปี แล้วหมั่นตรวจเช็คว่าถ้ามีรอยแตกเปลาะของสารซีลแลนต์ก็จัดการซีลใหม่ เพื่อไม่ให้กลีเซอรอลไหลออกมา

สรุปไดอะแกรมการทำสไลด์ถาวรของหนอนตัวกลม

เก็บตัวอย่างพืชหรือดิน สะกัดหนอนจากพืชหรือดิน ฆ่าและ fix ใน FA หรือ

PA 4:1 ที่ร้อนๆ

ซีลด้วยยาทาเล็บชนิดใส เมาต์ในแลคโตฟีนอล หรือ ย้อมสีและเคลียริ่งใน

กลีเซอรอล แลคโตฟีนอลที่ร้อนๆ

 

สรุปสั้นๆ การทำสไลด์ถาวรของหนอนตัวกลม

1. เก็บตัวอย่างพืช และดินที่มีหนอนตัวกลม

2. สะกัดหนอนตัวกลมจากพืชหรือดินด้วยวิธี Baermann funnel technique

3. ฆ่า และ fix หนอนตัวกลมใน ฟอร์มอล อะซิติก หรือ ฟอร์มอล โพรพิโอนิค

(FA หรือ FP 4:1) ที่ร้อนๆ

4. ย้อมสีและเคลียริ่งในแลคโตฟีนอล หรือ แลคโตกลีเซอรอลร้อนๆ ที่ผสมสี

0.05% แอซิดฟุคซิน

5. เมาต์และปิดคัพเวอร์กลาสหนอนตัวกลมที่อยู่ในหยดของแลคโตฟีนอลหรือ

กลีเซอรอลที่ไม่มีน้ำปน

6. ซีล (seal) ด้วยยาทาเล็บชนิดใส