DNA Sequencing

 

การหาลำดับเบสดีเอ็นเอ (DNA Sequencing)

ความเป็นมาของการหาลำดับเบสดีเอ็นเอ

*   ความก้าวหน้าของการหาลำดับเบสดีเอ็นเอ

*   Plus-and Minus Method

*   Dideoxynucleotide chain termination

*   Nobel Price in Chemistry 1980

*   PCR and Cycle sequencing

*   Automate sequencing

*   Genome sequencing และอื่นๆ

 

 

 


พัฒนาการของการหาลำดับเบสดีเอ็นเอโดยใช้การต่อสายดีเอ็นเอ

 

(Wu, 1993)

 

กลับไปที่ส่วนบน

Plus-and-Minus Method

(Wu, 1993)

 

กลับไปที่ส่วนบน

Dideoxynucleotide chain termination method

 

 

โครงสร้างทางเคมีของ NTP, dNTP และ ddNTP

 

การหาลำดับเบสโดยวิธี chain termination (Introduction to genetic analysis 7th eds.)

 

 

DNA sequence ladder

        *   Interesting web site: Access Excellence: DNA sequencing simulation

 

กลับไปที่ส่วนบน

 

Nobel Prize in Chemistry 1980

Frederick Sanger และ Walter Gilbert ไดรับรางวัลโนเบล สาขาเคมี ในปี 2543 (ค.ศ.1980) http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1980/ จากการค้นพบเทคนิคการหาลำดับเบสของดีเอ็นเอในปี 1977 โดย Sanger ได้พัฒนาเทคนิค dideoxy-chain termination ขึ้นมา และถูกนำมาใช้ในงานวิจัยด้านต่างๆ มากมายมาจนถึงปัจจุบัน อีกทั้งมีการพัฒนาให้กระบวนการเป็นระบบอัตโนมัติ ทำให้แพร่หลายไปในกลุ่มนักวิจัยโดยทั่วไป ส่วน วิธี chemical degradation ที่ Gilbert พัฒนาขึ้นมา ก็มีความสำคัญ และมีการใช้ประโยชน์ในช่วงปี ’80 ต้นๆ แต่มีการนำไปใช้ประโยชน์น้อย เนื่องจากมีวิธีการยุ่งยากกว่า และมี ความสามารถในการหาลำดับเบส (throughput) ต่ำกว่า

 

*   Nobel lecture ของ Sanger

*   Nobel lecture ของ Gilbert

 

กลับไปที่ส่วนบน

 

PCR and Cycle sequencing

หลังจาก Kary Mullis (Nobel in Chemistry ’93) ค้นพบเทคโนโลยี PCR ในปี 1983 เป็นเทคนิคที่ใช้ในการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอในหลอดทดลองโดยใช้ primer 2 สายที่จับกับดีเอ็นเอต่างเส้นกัน และมีทิศทางด้าน 3’ เข้าหากัน และใช้เอ็นไซม์ DNA polymerase ในการต่อสายดีเอ็นเอ โดยมีการทำปฏิกิริยาหลายรอบและได้จำนวนดีเอ็นเอโมเลกุลเพิ่มขึ้นเป็นทวีคูณ  ก็มีการนำเอา PCR มาใช้ในการหาลำดับเบสดีเอ็นเอ โดยใช้ primer เพียงข้างเดียวและ อาศัยเอ็นไซม์ Taq Polymerase ที่ทนอุณหภูมิสูงได้ดี แทน DNA polymerase ทั่วไป ที่ใช้ทำปฏิกิริยาที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ร่วมกับ วิธี dideoxynucleotide chain termination ของ Sangerโดยมีข้อได้เปรียบคือสามารถใช้กับตัวอย่างดีเอ็นเอที่มีโครงสร้างซับซ้อนได้ดี อีกทั้งลดขั้นตอนการทำปฏิกิริยาเป็นเพียงขั้นเดียว เรียกวิธีการนี้ว่า Cycle sequencing

 

(จาก http://www.lambda.at/images/sequencing2.gif)

 

*   Cycle sequencing animation at DNA Learning Center

*   Nobel lecture ของ Mullis

 

กลับไปที่ส่วนบน

 

Automate sequencer

Leroy Hood ได้พัฒนาเครื่องหาลำดับเบสดีเอ็นเออัตโนมัติ (Automate sequencer หรือ Autosequencer) ที่ใช้ลำแสงเลเซอร์ในการตรวจการเคลื่อนที่ของแถบดีเอ็นเอที่ติดฉลากไว้ด้วยสารเรืองแสง ในแผ่น acrylamide ขึ้นในปี 1986 ทำให้ลดขั้นตอนการอ่านผลซึ่งเป็นงานที่หนักและผิดพลาดได้ง่าย หลังจากนั้นได้มีพัฒนาการเครื่องautosequencer และ สารเคมีที่ใช้สำหรับเครื่อง autosequencer มาโดยตลอดจนถึงปัจจุบันจนมีประสิทธิภาพสูง สามารถหาลำดับเบสได้จำนวนมากภายในเวลาสั้นๆ เครื่อง Autosequencer ที่มีใช้ในปัจจุบันส่วนใหญ่เป็น ของบริษัท Applied Biosystem ซึ่งสามารถแบ่งได้เป็น 2 แบบ ได้แก่

  1. แบบ Slab gel เช่น ABI373 และ ABI377
  2. แบบหลอด Capillary เช่น ABI3100 และ ABI3700

แบบ slab gel จะต้องใช้ความชำนาญในการเทเจลและ หยอดเจล ในขณะที่ แบบ capillary ใช้ระบบอัตโนมัติในการเติมเจล และดูดตัวอย่างทำให้สามารถทำงานได้ต่อเนื่องและวิเคราะห์ลำดับเบสได้จำนวนมาก อีกทั้งไม่ต้องอาศัยประสบการณืในการดำเนินการมากนักทำให้เป็นที่นิยมใช้ทั่วไป

 

นอกจากเครื่องของบริษัท Applied Biosystem แล้วก็ยังมี Magabace 4000ของบริษัท Amersham Bioscience ที่มีหลอด capillary 384 หลอดทำให้สามารถหาลำดับเบสของตัวอย่าง 384 ตัวอย่างพร้อมๆกัน หรือคิดเป็น กว่า 1 ล้านเบสใน 8ชั่วโมง

 

กลับไปที่ส่วนบน

 

Genome sequencing และอื่นๆ

 

การหาลำดับเบสของทั้งจีโนมของสิ่งมีชีวิตมีแนวคิดริเริ่มในการหาลำดับเบสของจีโนมมนุษย์ตั้งแต่ปี 1986 โดยกระทรวงพลังงานของประเทศสหรัฐอเมริการ่วมกับหน่วยงานอื่นๆอีกหลายแห่งในการหาลำดับเบส 3000 ล้านเบส โดยจัดตั้ง Human Genome Project ขึ้นในช่วงเวลาที่เทคโนโลยีด้านการหาลำดับเบสยังต้องใช้ระบบ manual เป็นส่วนใหญ่ แต่ก็ได้มีการสร้างแผนที่โครโมโซมของมนุษย์โดยใช้โมเลกุลเครื่องหมายเช่น RFLP และมีการสร้างดีเอ็นเอไลบรารี่โดยใช้เวคเตอร์เช่น YAC (Yeast Artificial Chromosome) หรือ BAC (Bacteria Artificial Chromosome) ที่สามารถ สอดใส่ดีเอ็นเอขนาดโมเลกุลใหญ่ถึง 300-500 Kb และ 80-150 Kb ตามลำดับ จึงสามารถหาลำดับเบสของ ดีเอ็นเอได้ตาม YAC หรือ BAC ของแต่ละโครโมโซมได้ แต่ความก้าวหน้าของโครงการเป็นไปได้ช้าจนกระทั่งมีการพัฒนา automate sequencer มาใช้ในการหาลำดับเบส ประกอบกับการใช้เทคนิคใหม่ๆทางชีววิทยาโมเลกุล และทาง คอมพิวเตอร์ ที่ทำให้มีความรุดหน้าในการหาลำดับเบส ประกอบกับการแข่งขันจาก TIGR (The Institute for Genomic Research) ซึ่งเป็นองค์กรอิสระที่ได้ประกาศตัวในการหาลำดับเบสดีเอ็นเอของมนุษย์โดยใช้วิธี shot gun sequencing) ทำให้มีการทุ่มเททรัพยากรอีกทั้ง มีการพัฒนาเทคโนโลยีใหม่ๆ ซึ่งทำให้โครงการ human genome ถึงเป้าหมายก่อนเวลาที่ตั้งไว้หลายปี (ข้อมูลจากhttp://www.ornl.gov/TechResources/Human_Genome/)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Map based DNA sequencing

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Maxam and Gilbert Sequencing Methods

ในปี ค.ศ. 1977 ในเวลาเดียวกันกับที่ Sanger ได้ตีพิมพ์เทคนิค dideoxynucleotide chain termination นักวิทยาศาสตร์จาก ม. Harvard 2 คน ได้แก่ Maxam และ Gilbert ได้ตีพิมพ์วิธีการหาลำดับเบสโดยใช้การทำลายลำดับเบสที่จำเพาะเจาะจง (Chemical degradation method) และทำให้ Gilbert ได้รับรางวัลโนเบลไปในที่สุดพร้อมๆกับ Sanger

 

Maxam and Gilbert’s chemical degradation method

(http://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/genetics980211.html)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


นอกจากเทคนิคการหาลำดับเบสที่ได้กล่าวมาข้างต้นแล้วยังมีเทคนิคอื่นๆที่มีการพัฒนาขึ้นมาในปัจจุบันหรือกำลังพัฒนาอยู่เพื่อเป็นการเสริมหรือพัฒนาการหาลำดับเบสที่รวดเร็ว และแม่นยำขึ้น อีกทั้งมีต้นทุนในการดำเนินการที่ต่ำลง เช่น Pyrosequencing (www.pyrosequencing.com), DNA chip based DNA sequencing หรือ Mass spectrometry based DNA sequencing

 

กลับไปที่ส่วนบน

แก้ไขครั้งล่าสุด: 19 มิถุนายน 2548